El desafío fundamental en la ingeniería de proteínas ha sido que las enzimas naturales, aunque efectivas en sus funciones originales, presentan estabilidad marginal que limita su capacidad de evolucionar hacia nuevas funciones. Cuando una proteína acumula mutaciones para adquirir propiedades deseadas, frecuentemente pierde estabilidad estructural, lo que reduce su actividad catalítica en los nuevos sustratos. Este dilema ha obstaculizado durante años el desarrollo de enzimas modificadas para aplicaciones terapéuticas y de investigación.

El equipo de investigadores abordó este problema integrando el rediseño computacional de secuencias proteicas con la evolución dirigida en laboratorio. Utilizaron ProteinMPNN, un modelo de red neuronal basado en aprendizaje automático, para rediseñar tres tipos distintos de proteasas de toxina botulínica (BoNT/E, BoNT/F y BoNT/X) con el objetivo de mejorar su estabilidad térmica y expresión soluble mientras se mantenía su función catalítica original.

En el caso de BoNT/E, los investigadores evaluaron 74 diseños computacionales. De estos, 58 (78%) resultaron ser proteasas funcionales, y 33 (45%) mostraron tasas de escisión al menos tan altas como la proteasa silvestre original. Veintidós diseños (30%) tanto retuvieron actividad como expresaron con mayor rendimiento soluble que la proteasa silvestre. Los tres diseños de mejor desempeño (denominados D1, D2 y D3) mostraron eficiencias catalíticas de 260, 310 y 190 milimolar inverso por segundo, respectivamente, entre 1,7 y 2,8 veces superiores a la proteasa silvestre BoNT/E, que alcanzó 110 milimolar inverso por segundo.

El aspecto innovador del estudio radica en demostrar que estas proteasas rediseñadas sirven como puntos de partida superiores para la evolución dirigida. Los investigadores realizaron campañas de evolución paralelas utilizando tanto proteasas rediseñadas como proteasas silvestres como puntos de inicio. En todos los casos, la evolución iniciada con proteasas rediseñadas por ProteinMPNN produjo consistentemente proteasas con mayor actividad que aquellas evolucionadas a partir de proteasas silvestres en las mismas condiciones de selección.

El mecanismo detrás de esta mejora es que el rediseño computacional expande el espacio funcional de secuencias accesibles durante la evolución. Las proteasas rediseñadas son más robustas a mutaciones, lo que significa que pueden tolerar cambios genéticos que serían perjudiciales en la proteasa silvestre. Esta robustez mutacional permite que las enzimas evolucionen nuevas funciones a una velocidad más rápida y con mayor tasa de éxito.

Para validar la aplicabilidad clínica del enfoque, los investigadores evolucionaron tanto proteasas silvestres como rediseñadas de BoNT/E para escindir selectivamente ataxina-2, una proteína de relevancia terapéutica para enfermedades neurodegenerativas. Las proteasas evolucionadas a partir del punto de partida rediseñado alcanzaron una eficiencia catalítica superior y mayor estabilidad térmica en comparación con las variantes evolucionadas a partir de BoNT/E silvestre. Más significativamente, lograron una especificidad 79 veces mayor para ataxina-2 que la mejor variante evolucionada a partir de la proteasa silvestre, mientras minimizaban la escisión del sustrato nativo.

El equipo también comparó el rendimiento de ProteinMPNN con PROSS, un método computacional anterior que utiliza cálculos de energía de Rosetta y estadísticas evolutivas para predecir mutaciones estabilizadoras. De 82 variantes diseñadas con PROSS, 33 (40%) fueron al menos tan activas y altamente expresadas como BoNT/E silvestre. Los tres diseños de mejor desempeño de PROSS (PROSS1, PROSS2 y PROSS3) mostraron expresión mejorada, estabilidad y cinética enzimática similar a los diseños ProteinMPNN, aunque los diseños ProteinMPNN de mejor clasificación alcanzaron una temperatura de fusión promedio de 55,2 grados Celsius, superior a los 52,3 grados Celsius de los diseños PROSS.

El estudio también demostró que el rediseño puede rescatar la estabilidad degradada de una proteasa altamente evolucionada mientras retiene su especificidad novedosa. Los investigadores tomaron una proteasa BoNT/E previamente evolucionada para escindir PTEN (una proteína objetivo terapéutica no relacionada con ningún sustrato conocido de toxina botulínica) e injertaron sus 16 mutaciones evolucionadas en los fondos rediseñados D1, D2 y D3. Las proteasas resultantes expresaron a niveles 4,2, 2,2 y 5,2 veces superiores respectivamente en comparación con la proteasa evolucionada original, mientras mantenían su capacidad de escindir PTEN y su especificidad reprogramada.

Las implicaciones de este trabajo se extienden más allá de las proteasas de toxina botulínica. El enfoque integrado de rediseño computacional seguido de evolución dirigida en laboratorio establece un flujo de trabajo práctico aplicable a cualquier proteína que requiera nuevas propiedades funcionales. Esto incluye aplicaciones en investigación biomédica, desarrollo de terapéuticos, síntesis química y ciencia ambiental.

El método utiliza evolución asistida por fagos (PACE), una técnica que realiza docenas de generaciones de mutación, selección y replicación cada 24 horas sin intervención del investigador. Esta capacidad de evolución acelerada, combinada con puntos de partida computacionalmente optimizados, reduce significativamente el tiempo y los recursos necesarios para desarrollar enzimas con propiedades específicas.

Los investigadores señalan que aunque los métodos de aprendizaje automático han avanzado rápidamente en el diseño de novo de enzimas, las enzimas diseñadas de novo típicamente tienen tasas catalíticas inferiores a sus contrapartes naturales. El enfoque presentado en este estudio evita este problema al comenzar con proteínas naturales como plantillas, mejorando su estabilidad computacionalmente, y luego permitiendo que la evolución dirigida optimice la función para nuevos sustratos.

El trabajo establece un precedente importante para la ingeniería de proteínas del siglo XXI: la combinación sinérgica de inteligencia artificial y evolución biológica dirigida puede superar las limitaciones de cada enfoque por separado. Las proteasas rediseñadas no solo son mejores puntos de partida para la evolución, sino que también permiten acceder a espacios de secuencias funcionales que serían inaccesibles comenzando desde proteínas silvestres, como se confirmó por la incapacidad de las mutaciones evolucionadas a partir de diseños rediseñados de funcionar en fondos de enzimas silvestres.