Científicos desarrollan método revolucionario para descubrir enzimas mediante coordinación metálica

El descubrimiento de nuevas enzimas ha dependido tradicionalmente de la casualidad y métodos basados en similitud de secuencias genéticas, que enfrentan limitaciones significativas debido a la compleja historia evolutiva de las proteínas. Sin embargo, investigadores han presentado una metodología guiada por coordinación metálica que utiliza principios mecanísticos a nivel atómico para identificar metalloenzimas de manera dirigida, según el estudio publicado en Nature.

La estrategia fue aplicada a la base de datos de estructuras proteicas AlphaFold2 para identificar nuevos miembros de la familia de halogenasas dependientes de hierro II y alfa-cetoglutarato, enzimas que funcionalizan selectivamente enlaces carbono-hidrógeno no activados, una transformación crucial en la producción de productos farmacéuticos y otros compuestos de alto valor, según los investigadores.

Las halogenasas radicales constituyen una clase de baja abundancia dentro de la superfamilia cupin, grande y diversa. Debido a la baja conservación de secuencias, han sido especialmente difíciles de encontrar contra el complejo trasfondo de miembros de familias relacionadas, como hidroxilasas, desaturasas y epimerasas, según el estudio.

METODOLOGÍA DE MINERÍA POR COORDINACIÓN METÁLICA

La metodología de minería por coordinación metálica reveló varias familias de halogenasas radicales previamente no reconocidas que abarcan un espacio filogenético diverso, con un costo computacional mínimo, según los investigadores. Las predicciones fueron validadas mediante la caracterización experimental de dos nuevas halogenasas radicales: AspX y BtnX.

Se estima que entre el 25% y el 50% de las proteínas requieren un ion metálico para su función, utilizando las propiedades redox, ácido-base y estructurales ajustables de los iones metálicos para expandir el espacio de reacción más allá de lo posible con los grupos funcionales de aminoácidos estándar, según el estudio.

Los sitios metálicos biológicos están gobernados por restricciones geométricas específicas relacionadas directamente con sus mecanismos catalíticos, como aquellas definidas por enlaces de coordinación metálica distintos con ligandos derivados de proteínas, interacciones de segunda esfera y redes de enlaces de hidrógeno, según los investigadores. Estos tipos de interacciones mecánicamente relevantes establecen motivos tridimensionales que pueden usarse para la minería estructural dirigida de sitios específicos de unión a metales, así como para su clasificación funcional precisa.

APLICACIÓN A LA SUPERFAMILIA CUPIN

La superfamilia cupin se encuentra en todos los dominios de la vida y exhibe una gama excepcionalmente amplia de funciones bioquímicas, comparable a la versatilidad de la superfamilia del barril triosa fosfato isomerasa, según el estudio. Su historia evolutiva es compleja, pero parece estar centrada alrededor de un motivo 3His-1Glu ubicado dentro de un pliegue de barril de doble hélice beta característico y termoestable.

Las enzimas dependientes de hierro II y alfa-cetoglutarato utilizan el superfamilia cupin y participan en una amplia gama de transformaciones metabólicas, desde la modificación de proteínas hasta pasos clave en la biosíntesis de antibióticos y otros productos naturales, según los investigadores. Estas enzimas utilizan un cofactor de hierro II mononuclear no hemo y el co-sustrato alfa-cetoglutarato para unirse y activar el oxígeno molecular y generar un intermediario reactivo de hierro IV-oxo.

Sin embargo, este intermediario compartido puede catalizar una amplia gama de reacciones, como hidroxilación, desaturación, ciclización y halogenación, según el estudio. Los miembros prototípicos de esta familia se unen al hierro II utilizando un motivo de "tríada facial" 2His-1Asp/Glu derivado de cupin y el co-sustrato alfa-cetoglutarato para formar la esfera de coordinación primaria del metal.

Los miembros de halogenasas radicales están distribuidos en baja frecuencia dentro de varias familias de enzimas dependientes de hierro II y alfa-cetoglutarato, pero son mecánicamente distintos con respecto a su capacidad para transferir un anión unido al hierro al sustrato. Este paso necesita la presencia de un sitio de coordinación abierto para la coordinación de haluro al hierro II, que se observa como la conversión del motivo 2His-1Asp/Glu al motivo no canónico 2His-1Gly/Ala en todos los miembros previamente reportados, según los investigadores.

PROCESO DE DESCUBRIMIENTO

Se compiló una base de datos estructural de la familia de enzimas dependientes de hierro II y alfa-cetoglutarato recuperando primero secuencias de proteínas anotadas para contener el dominio cupin (1,8 millones) de los aproximadamente 220 millones de secuencias en la base de datos InterPro, según el estudio. Después de un paso de filtrado inicial para eliminar fragmentos, duplicados y no enzimas, se recuperaron los modelos estructurales correspondientes de la base de datos de estructuras proteicas AlphaFold2 (530.814 estructuras).

Estas estructuras fueron minadas para la presencia de un sitio de unión 2His utilizando la relación única de distancia y orientación que permitiría a dos residuos His intra-cadena actuar como un sitio de unión a metal, según los investigadores. Se encontró que tres restricciones eran suficientes para describir este sitio, con dos enlaces de hidrógeno entre los grupos amida y carbonilo de la cadena principal de HisA y HisB definiendo su ubicación en cadenas beta adyacentes, y la distancia Nτ-Nτ de la cadena lateral definiendo su preorganización para la coordinación metálica.

La mayoría de estas estructuras predichas contenían un sitio de unión a metal 2His con un residuo Asp/Glu adicional en proximidad de coordinación al sitio metálico (456.585 estructuras); una pequeña minoría carecía de un residuo coordinante cercano y en su lugar contenía un residuo Ala/Gly (946 estructuras), sugiriendo actividad de halogenasa radical, según el estudio.

VALIDACIÓN EXPERIMENTAL

La red de similitud de secuencias de estas halogenasas radicales predichas incluye todas las halogenasas radicales previamente conocidas y experimentalmente verificadas, lo que sirve como una validación positiva inicial de la metodología, según los investigadores. Esta red captura grupos de halogenasas radicales (más del 30% de identidad de secuencia) con una cobertura mucho mayor que la que se puede lograr utilizando métodos basados únicamente en secuencias.

El atlas bioinformático completo de halogenasas radicales contiene 70 grupos que parecen estar completamente inexplorados, sin anotación previa de halogenasa radical, y que abarcan un vasto espacio taxonómico y filogenético de secuencias de proteínas, incluidas varias nuevas familias de halogenasas eucariotas, según el estudio.

Motivados para validar aún más la plataforma de descubrimiento de metalloenzimas y aplicarla hacia el descubrimiento de halogenasas dependientes de hierro II y alfa-cetoglutarato, los investigadores seleccionaron una nueva familia de su red de similitud de secuencias (grupo X) para validación experimental. El grupo X fue intrigante debido al contexto genómico diverso de sus miembros putativos de halogenasa radical; algunos estaban co-agrupados con genes relacionados con proteínas transportadoras de acilo, indicando que podrían ser halogenasas radicales dependientes de estas proteínas, mientras que otros carecían de estos genes vecinos, sugiriendo que utilizan sustratos independientes, según los investigadores.

DESCUBRIMIENTO DE ASPX

Un análisis de los vecindarios genómicos de candidatos a halogenasa radical en el grupo X reveló subfamilias en las que los genes de sus miembros de halogenasa radical independientes de proteínas transportadoras de acilo están adyacentes a aquellos que codifican transportadores de aminoácidos y enzimas modificadoras de aminoácidos, según el estudio. Basándose en esta observación, los investigadores plantearon la hipótesis de que algunas de estas halogenasas radicales actúan sobre aminoácidos libres.

Se seleccionó una halogenasa radical putativa del patógeno marino Vibrio campbelli, denominada AspX, de uno de estos subgrupos para validación bioquímica, según los investigadores. La reacción in vitro de AspX con una mezcla de los 20 aminoácidos canónicos L analizados por cromatografía líquida-espectrometría de masas de tiempo de vuelo cuadrupolar muestra que AspX clora selectivamente el ácido L-aspártico pero no actúa sobre ninguno de los otros aminoácidos.

La caracterización por resonancia magnética nuclear del producto aislado de AspX y la cinética de estado estacionario muestran que AspX convierte el ácido L-aspártico en ácido 3S-cloro-L-aspártico (constante catalítica kcat = 33,3 ± 0,5 min-1, constante de Michaelis Km = 0,64 ± 0,02 mM, número de recambio = 780 ± 107), según el estudio. AspX también puede transferir aniones alternativos (Br- y N3-) para producir derivados bromo y azido del ácido L-aspártico.

El descubrimiento de AspX extiende el alcance previamente reportado de halogenasas de aminoácidos libres que actúan sobre aminoácidos cargados positivamente (L-lisina y L-ornitina) y no polares (L-leucina, L-isoleucina y L-norleucina) al primer caso de un aminoácido cargado negativamente (ácido L-aspártico), según los investigadores.

DESCUBRIMIENTO DE BTNX

Otra subfamilia del grupo X está ubicada en la unión de halogenasas dependientes de proteínas transportadoras de acilo y halogenasas independientes, según el estudio. Aunque sus miembros comparten cierta similitud de secuencia con la halogenasa conocida dependiente de estas proteínas CurA (alrededor del 25-30% de identidad de secuencia), muchos de sus grupos de genes biosintéticos asociados carecen de genes asociados con halogenasas dependientes de proteínas transportadoras de acilo, planteando la posibilidad de que acepten sustratos alternativos y posiblemente grandes.

Se seleccionó una halogenasa radical putativa de esta subfamilia, denominada BtnX, del patógeno de algas Kordia algicida para caracterización bioquímica, según los investigadores. BtnX muestra una promiscuidad de sustrato sin precedentes en halogenasas radicales, abriendo el camino para una amplia gama de aplicaciones biocatalíticas, según el estudio.

La reacción in vitro de BtnX con biotina muestra conversión a 2R-clorobiotina, según los investigadores. BtnX está co-localizada con un complejo transportador de factor de acoplamiento de energía para la captación de biotina que se encuentra en un "plásmido asesino" y se regula al alza durante el parasitismo bacteriano-algal.

Notablemente, BtnX acepta una amplia gama de sustratos que contienen ácidos carboxílicos alfa, incluidos aminoácidos, ácidos grasos de cadena corta y media, y cofactores como biotina y ácido lipoico, según el estudio. Esta promiscuidad de sustrato es sin precedentes entre las halogenasas radicales caracterizadas hasta la fecha.

IMPLICACIONES Y APLICACIONES

El atlas bioinformático expandido y refinado de halogenasas radicales proporciona un recurso valioso para la comunidad científica más amplia que puede permitir investigar transformaciones químicas novedosas en contextos biológicos únicos y puede acelerar el descubrimiento de nuevos biocatalizadores con tuberías experimentales de alto rendimiento existentes, según los investigadores.

La metodología de minería por coordinación metálica aborda tanto el desafío de sensibilidad, al usar reglas de agrupamiento geométrico en espacio tridimensional para mejorar la señal de detección más baja de puntuaciones de alineación no dirigidas en espacio unidimensional, como el de escalabilidad, al usar una búsqueda de motivo estructural que escala linealmente con el número de secuencias, según el estudio.

Los avances en la predicción de estructuras proteicas han permitido el desarrollo de grandes bases de datos que ofrecen nuevas oportunidades para el descubrimiento basado en estructuras, según los investigadores. Sin embargo, es más común encontrar que pliegues estables han sido reclutados repetidamente a lo largo de la evolución y por lo tanto pueden soportar una gama extremadamente amplia de funciones, lo que dificulta hacer predicciones precisas.

Las funciones enzimáticas distintas dentro de un pliegue estructural deberían dar lugar a diferencias conservadas en el mecanismo de reacción química que pueden correlacionarse con divergencia estructural a nivel atómico en el sitio activo, según el estudio. Este marco conceptual sugiere que la información mecanística clave podría estar codificada en representaciones atomísticas de la química del sitio activo y guiar la minería a gran escala de bases de datos de estructuras proteicas para el descubrimiento dirigido de enzimas con funciones deseadas.

La revolución reciente en la secuenciación del genoma y la predicción de estructuras proteicas ha abierto nuevas fronteras en la comprensión, predicción y diseño de la función enzimática, según los investigadores. Central a estos esfuerzos es el descubrimiento y la anotación funcional de nuevas enzimas, que es esencial para elucidar la conexión entre genotipo y fenotipo y para desarrollar biocatalizadores para aplicaciones industriales.

Sin embargo, predecir con precisión la función enzimática sigue siendo un desafío importante, y el descubrimiento de nuevas enzimas a menudo depende de la casualidad, según el estudio. La metodología presentada ofrece una alternativa sistemática y dirigida que aprovecha principios mecanísticos fundamentales para identificar enzimas con funciones específicas deseadas en el vasto espacio de secuencias y estructuras proteicas disponibles.