Modificación química ac4C supera al estándar industrial en terapias de ARN mensajero sintético

La N4-acetilcitidina (ac4C) emerge como una alternativa funcionalmente superior a la N1-metilpseudouridina (m1Ψ) en la producción de ARN mensajero (ARNm) sintético terapéutico, según un estudio publicado en Nature que documenta mayor rendimiento proteico y fidelidad traslacional en múltiples sistemas biológicos.

Las terapias de ARNm sintético, plataforma que incluye las vacunas contra COVID-19, utilizan moléculas de ARN producidas in vitro que programan células para expresar proteínas específicas. Estas moléculas incorporan ribonucleótidos modificados para mejorar estabilidad, aumentar traducción y reducir reconocimiento inmunitario, según explica el estudio. La m1Ψ se ha establecido como el estándar industrial por su efectividad en promover traducción y reducir inmunogenicidad.

Sin embargo, investigaciones recientes han demostrado que la m1Ψ compromete la fidelidad traslacional, generando errores como terminación prematura y cambios de marco de lectura ribosomal, según documenta el artículo. Estos errores producen neoantígenos no intencionados que plantean preocupaciones de seguridad para aplicaciones terapéuticas.

**Rendimiento superior en múltiples sistemas**

Los investigadores sintetizaron ARNm codificando la proteína bioluminiscente NanoLuciferasa mediante transcripción in vitro, sustituyendo citidina por ac4C o 5-metilcitidina (m5C), y uridina por pseudouridina (Ψ) o m1Ψ. Todos los ARNm fueron encapsulados co-transcripcionalmente y poliadenilados, según detalla el estudio.

En células HeLa transfectadas con nanopartículas lipídicas, el ARNm modificado con ac4C produjo mayores niveles de proteína NanoLuc que todas las demás condiciones, incluyendo m1Ψ, según mediciones de luminiscencia e inmunotransferencia. Los ARNm modificados químicamente exhibieron vidas medias prolongadas relativas al ARNm no modificado, aunque las cinéticas generales de degradación fueron similares, según confirma el análisis por PCR cuantitativa con transcripción reversa.

La activación inmunitaria fue mínima en células HeLa, con todos los ARNm producidos in vitro induciendo poca o ninguna expresión de IFNB1 o fosforilación de eIF2α, según reporta el estudio. La ventaja traslacional de ac4C persistió cuando los ARNm fueron sintetizados usando una polimerasa T7 mutante G47A+884G, que suprime subproductos inmunogénicos de ARN de doble cadena. Los niveles de proteína NanoLuc permanecieron más altos para ARNm modificado con ac4C, incluso cuando la fosforilación de eIF2α se redujo aún más en comparación con la polimerasa T7 silvestre, según documenta el artículo.

**Efectos directos sobre la maquinaria traslacional**

Para aislar los efectos directos de las modificaciones nucleotídicas sobre la traducción, los investigadores utilizaron lisado de reticulocitos de conejo, un sistema libre de células que retiene la maquinaria traslacional central pero carece de vías inmunitarias innatas clave. El ARNm no modificado se degradó rápidamente, mientras que los transcritos modificados permanecieron estables durante la ventana de muestreo, según observaciones del estudio.

La luminiscencia del ARNm no modificado alcanzó una meseta en 30 minutos, mientras que la luminiscencia de ARNm modificados con m5C y m1Ψ se acumuló durante períodos más largos antes de estabilizarse. En contraste, el ARNm modificado con ac4C sostuvo síntesis proteica aumentada y continua durante todo el curso temporal, sin una meseta clara, según reporta el análisis. La inmunotransferencia confirmó el aumento de proteína NanoLuc del ARNm modificado con ac4C a lo largo del tiempo sin fosforilación detectable de eIF2α, según documenta el estudio.

Para evaluar si la ventaja traslacional de ac4C se extiende a proteínas de membrana, los investigadores analizaron CD25, un receptor transmembrana terapéuticamente relevante cuya deficiencia se asocia con disregulación inmunitaria severa. El ARNm modificado con ac4C produjo niveles más altos de proteína CD25 que los transcritos modificados con m1Ψ y no modificados, según mediciones por inmunotransferencia y citometría de flujo.

A las 6 horas después de la transfección, la intensidad media de fluorescencia y la fracción de células CD25 altas aumentaron para ac4C en relación con m1Ψ y ARNm no modificados, según documenta el estudio. Cuando la incubación con nanopartículas lipídicas se extendió a 24 horas y la expresión de CD25 se monitoreó durante 96 horas, la intensidad media de fluorescencia fue consistentemente más alta para ARNm modificado con ac4C durante todo el curso del experimento, según reporta el análisis.

**Supresión inmunitaria en células relevantes terapéuticamente**

Los investigadores evaluaron el desempeño de ac4C en contextos terapéuticamente relevantes, incluyendo células inmunitarias, fibroblastos primarios e hígado in vivo. Macrófagos M0 derivados de THP-1 y células dendríticas derivadas de monocitos humanos primarios (MoDCs) fueron priorizados dada su alta expresión de receptores de reconocimiento de patrones y su papel central en respuestas a vacunas de ARNm, según explica el estudio.

El ARNm no modificado indujo fuerte activación inmunitaria, evidenciada por niveles aumentados de IFNB1, TNF y fosforilación de eIF2α, mientras que ac4C y m1Ψ suprimieron estas respuestas a niveles similares en macrófagos M0, según documenta el artículo. No obstante, el ARNm modificado con ac4C condujo a mayores rendimientos de proteína NanoLuc, según mediciones de luminiscencia.

Un patrón similar emergió en MoDCs primarias de donantes humanos. Ambas modificaciones redujeron la activación inmunitaria en relación con ARNm no modificado, con ac4C conduciendo a niveles modestamente más bajos de IFNB1, TNF y fosforilación de eIF2α. Sin embargo, ac4C nuevamente aumentó los rendimientos de proteína NanoLuc a través de muestras de donantes humanos, según reporta el estudio.

Las MoDCs son particularmente sensibles al ARN de doble cadena, que activa la proteína quinasa R (PKR) para fosforilar eIF2α y reprimir la traducción, y activa el receptor tipo Toll 3 (TLR3) para impulsar respuestas de interferón tipo I, según explica el artículo. La inhibición farmacológica de PKR igualó los niveles de fosforilación de eIF2α entre condiciones, pero el ARNm modificado con ac4C aún produjo la mayor cantidad de proteína NanoLuc, incluyendo en relación con m5C y ARNm doblemente modificados, según documenta el estudio.

La transfección de ARNm producidos in vitro sintetizados con la polimerasa T7 mutante que minimiza ARN de doble cadena eliminó similarmente las diferencias en activación inmunitaria entre ac4C y m1Ψ, mientras que ac4C mantuvo mayor expresión de proteína NanoLuc a través de muestras de donantes, según reporta el análisis.

**Mecanismo de supresión inmunitaria compartido**

Un mecanismo principal por el cual las modificaciones de uridina limitan respuestas inmunitarias al ARNm producido in vitro es reduciendo la señalización a través de los receptores sensores de uridina TLR7 y TLR8. Investigaciones recientes han demostrado que Ψ y m1Ψ logran este efecto disminuyendo el clivaje mediado por RNasa T2, según cita el estudio.

Los ensayos de clivaje in vitro revelaron resistencia comparable a RNasa T2 para ac4C y m1Ψ, mientras que m5C mostró sensibilidad intermedia, según documenta el artículo. La supresión similar de respuestas inmunitarias conferida por ac4C y m1Ψ probablemente refleja un mecanismo compartido, mientras que sus efectos divergentes sobre la producción proteica surgen de diferencias en la traducción misma, según concluye el estudio.

**Validación in vivo en hígado de ratón**

La administración intravenosa de ARNm NanoLuc encapsulado en nanopartículas lipídicas FIII-7 en ratones BALB/c condujo a un aumento de aproximadamente 3.5 veces en luminiscencia hepática para ac4C en comparación con m1Ψ a las 24 horas, según reporta el estudio. Las propiedades de las nanopartículas lipídicas fueron comparables entre modificaciones, y los niveles residuales de ARNm m1Ψ hepático excedieron los de ac4C, excluyendo la administración diferencial como explicación para los resultados observados, según documenta el análisis.

Una ventaja similar se observó en fibroblastos embrionarios de ratón, donde ac4C condujo a mayores niveles de proteína NanoLuc en relación con m1Ψ a pesar de eficiencias de transfección similares, según reporta el estudio.

**Dinámica traslacional a nivel de molécula única**

Para investigar los mecanismos subyacentes a nivel de transcritos individuales, los investigadores utilizaron imágenes de molécula única de péptidos nacientes (SINAPs), técnica que mide traducción específicamente en ARNm que han alcanzado exitosamente el citoplasma, evitando artefactos de diferencias en escape endosomal, según explica el estudio.

El reportero SINAPs consiste en un arreglo de epítopos SunTag amino-terminal que recluta anticuerpos de fragmento variable de cadena única fusionados a proteína verde fluorescente superfolder (scFv-sfGFP) expresados constitutivamente hacia péptidos nacientes a medida que emergen del canal de salida del ribosoma para marcar sitios de traducción activa, según describe el artículo.

Las células HeLa fueron transfectadas con ARNm SunTag modificados con ac4C, m1Ψ o no modificados, y se realizaron imágenes de lapso de tiempo de células vivas. El número de sitios de traducción activos por célula fue similar entre ARNm modificados con ac4C y m1Ψ, pero ambos excedieron al ARNm no modificado, según documenta el estudio. La intensidad de fluorescencia por sitio de traducción, que refleja la densidad ribosomal, fue comparable entre ac4C y m1Ψ pero mayor que para ARNm no modificado, según reporta el análisis.

**Velocidad de elongación diferencial**

A pesar de densidades ribosomales similares, el ARNm modificado con ac4C produjo más proteína que el modificado con m1Ψ, sugiriendo diferencias en la velocidad de elongación traslacional, según plantea el estudio. Para medir directamente la elongación, los investigadores utilizaron imágenes de lapso de tiempo de alta resolución de eventos de traducción individuales.

La traducción con ARNm modificado con m1Ψ fue casi dos veces más lenta que con ac4C, resultando en producción proteica reducida, según documenta el estudio. La elongación más lenta con m1Ψ aumentó las colisiones ribosomales, que limitaron aún más la producción proteica a través del compromiso de vías de control de calidad y cambio de marco +1, según reporta el análisis.

El ARNm modificado con ac4C mostró velocidades de elongación comparables al ARNm no modificado pero con mayor densidad ribosomal, resultando en mayor producción proteica sin los errores traslacionales asociados con m1Ψ, según documenta el estudio.

**Fidelidad traslacional mejorada**

Estudios recientes han demostrado que m1Ψ compromete la fidelidad traslacional, conduciendo a terminación prematura y cambio de marco ribosomal, según cita el artículo. Para evaluar la fidelidad traslacional de ac4C, los investigadores utilizaron reporteros que detectan errores de traducción específicos.

El ARNm modificado con ac4C mostró tasas de error significativamente más bajas que m1Ψ en ensayos de terminación prematura y cambio de marco, con fidelidad comparable al ARNm no modificado, según documenta el estudio. Esta fidelidad mejorada se atribuyó a la velocidad de elongación más rápida de ac4C, que reduce colisiones ribosomales y el compromiso subsecuente de vías de control de calidad que promueven errores, según explica el análisis.

**Implicaciones para diseño terapéutico**

Los hallazgos subrayan la importancia del contexto en el diseño de ARNm terapéuticos y posicionan la velocidad de elongación traslacional como un determinante clave de la eficacia de ribonucleótidos modificados, según concluye el estudio.

La ac4C, como modificación de citidina, está inherentemente excluida de codones de inicio y parada, sitios donde las modificaciones nucleotídicas pueden interrumpir iniciación y terminación, según explica el artículo. Esta propiedad, combinada con su capacidad para estabilizar el apareamiento de bases Watson-Crick con guanosina, fortalece interacciones con ARN de transferencia cognados y promueve formación de estructura secundaria de ARN, según documenta el estudio.

El efecto neto es una modulación dependiente de posición de la traducción. En secuencias codificantes, ac4C promueve elongación traslacional mejorando la eficiencia de decodificación ARN de transferencia-ARNm. Conversamente, en regiones no traducidas 5', ac4C inhibe iniciación traslacional formando estructuras que obstaculizan el escaneo ribosomal, según reporta el análisis.

Para evitar efectos inhibitorios de ac4C sobre iniciación traslacional, las plantillas de transcripción in vitro fueron diseñadas con regiones no traducidas 5' sin citidina que preservaron la secuencia Kozak, restringiendo ac4C a la secuencia codificante, según explica el estudio.

De aproximadamente 170 modificaciones de ARN conocidas, solo un pequeño subconjunto ha sido evaluado para aplicaciones terapéuticas de ARNm, según documenta el artículo. Los resultados establecen que ac4C suprime respuestas inmunitarias al ARNm producido in vitro mientras aumenta traducción a través de procesos mecánicamente desacoplados, ofreciendo una alternativa o estrategia complementaria para optimizar seguridad y eficacia de terapias de ARNm, según concluye el estudio.

La plataforma de ARNm sintético ha madurado en una plataforma terapéutica versátil, ejemplificada por vacunas basadas en ARNm contra COVID-19 que programan células para expresar proteínas virales inmunogénicas, según contextualiza el artículo. A diferencia de transcritos endógenos que se exportan directamente al citosol, los ARNm producidos in vitro ingresan células a través de vías endosomales que activan sensores inmunitarios innatos, induciendo respuestas de interferón tipo I y fosforilación de eIF2α que promueve degradación de ARN y represión traslacional global, según explica el estudio.

La incorporación uniforme de trifosfatos de nucleósidos modificados durante transcripción in vitro mitiga detección inmunitaria y aumenta estabilidad de ARNm y producción proteica, según documenta el artículo. Sin embargo, las observaciones de que el estándar industrial actual m1Ψ compromete fidelidad traslacional y genera neoantígenos no intencionados resaltan la necesidad de estrategias alternativas o complementarias para optimizar seguridad y eficacia de terapias de ARNm, según concluye el estudio publicado en Nature.